| 张帅,程晓磊,刘曦,等.葡萄糖激酶的异源表达及葡萄糖激酶激动剂筛选体系的建立[J].中国海洋药物,2020,39(5):1-8. |
| 葡萄糖激酶的异源表达及葡萄糖激酶激动剂筛选体系的建立 |
| Heterologous expression of glucokinase and establishment of a glucokinase agonist screening system |
| 投稿时间：2020-02-29 修订日期：2020-04-04 |
| DOI： |
| 中文关键词: 葡糖糖激酶 葡萄糖激酶激动剂 异源表达 2型糖尿病 |
| English Keywords: |
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| 中文摘要: |
| 目的 葡萄糖激酶（GK）是治疗2型糖尿病的重要靶标。旨在通过原核表达获得人源GK，并建立葡萄糖激酶激动剂（GKAs）分子筛选体系，用于筛选靶向GK的抗2型糖尿病先导化合物。方法 采用基因重组的方法构建GK原核重组表达载体GK-pET28a，将其转化入感受态细胞BL21（DE3）中，采用IPTG诱导重组蛋白的表达，且对诱导条件进行优化。接下来使用Ni-NTA对融合蛋白进行分离纯化。通过Western-blot鉴定蛋白且通过双酶偶联法对蛋白酶进行活力测试。最后建立葡萄糖激酶激动剂分子筛选体系，筛选活性化合物，并通过表面等离子共振技术（SPR）和计算机分子模拟技术探究活性化合物与葡萄糖激酶的结合情况。结果 通过基因重组将葡萄糖激酶与pET28a原核表达载体构建成融合质粒，并且确定最佳诱导表达条件为：0.5 mmol·L-1, 37 ℃，4～5 h。最佳纯化条件为：含10 mmol·L-1咪唑缓冲液洗杂蛋白，含100 mmol·L-1咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。通过Western-Blot鉴定表达的蛋白为目的蛋白，且蛋白酶具有较高的活力。成功建立GKAs分子筛选体系。最后，利用SPR技术确定活性化合物与GK有较强的结合，并采用分子对接对其结合位点进行了预测。 |
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